Biochemical insights into Energy Coupling Factor (ECF) transporters and exploration of the inhibitory potential of novel binders
ECF-transporters als nieuwe antimicrobiële aangrijpingspunten
Yue Li onderzocht de structuur, het mechanisme en het potentieel van zogeheten ECF-transporters als nieuwe antimicrobiële aangrijpingspunten. ABC-transporters, alomtegenwoordig in levende cellen en dus het leven, gebruiken ATP-hydrolyse om diverse substraten via membranen te verplaatsen door middel van geconserveerde cytoplasmatische nucleotidebindende domeinen. Hun Type III-subklasse (energy coupling factor-transporters, ECF-transporters), die uitsluitend in prokaryoten voorkomt, maakt gebruik van unieke mechanismen voor de opname van micronutriënten.
Li: ‘PdxU2, het substraatbindende domein voor microbiële vitamine B6-opname in ECF-transporters, werd gekloneerd uit het diepzee-hyperthermofiele archaeon Pyrococcus abyssi en gezuiverd met behulp van detergentia om stabiliteit te behouden. Een laagresolutiestructuur (4,6 Å) werd verkregen, maar ligandbinding bleef onopgelost.
Mechanistische studies met ECF-PanT en ECF-FolT2, die respectievelijk vitamine B5 en B9 transporteren uit Lactobacillus delbrueckii, gereconstitueerd in proteoliposomen, toonden aan dat deze transporters ATP-hydrolyse vereisen, niet erg pH-gevoelig zijn maar wel aanzienlijke thermische gevoeligheid vertonen, wat wijst op substantiële conformationele herstructurering tijdens de katalyse.
ECF-transporters komen uitsluitend voor in prokaryoten, waaronder pathogenen, en vormen een tot nu toe onderbenut medicijndoelwit. Een systematische structuur-activiteitsrelatie- (SAR-) studie van ECF-remmers identificeerde belangrijke determinanten voor inhibitie. We bevestigden de antimicrobiële activiteit van onze remmers tegen de humane pathogeen S. pneumoniae en toonden aan dat de effectiviteit correleert met de expressie van ECF-transporters, waarmee ze worden vastgesteld als nieuwe ‘druggable’ doelwitten in de strijd tegen antimicrobiële resistentie.
Nanobodies (Nbs), met hun monomere architectuur en hoge specifieke affiniteit, zijn krachtige structurele hulpmiddelen. We genereerden nanobodies tegen ECF-PanT. Biochemische validatie bevestigde binding, en opnamenassays in proteoliposomen toonden aan dat Nbs de ATP-afhankelijke opname remmen. Twee Nbs vertoonden nanomolaire affiniteit voor ECF-FolT2. Cryo-EM-structuren van Nb-ECF-FolT2 in detergentmicellen onthulden Nb-bindingsplaatsen op het nucleotidebindende domein (EcfA), en de complexen bleken zich in de apo-conformatie te bevinden.’