Engineering biological nanopores for proteomics study

Nieuwe techniek om eiwitten te identificeren

Nanoporiën zijn eiwitcomplex die in een (kunstmatige) celmembraan zitten. Deze poriën zijn met succes gebruikt voor DNA-sequencing, het aflezen van de genetische code. De nanoporiën worden echter veel minder gebruikt voor de eiwitanalyse of eiwit-sequencing, vanwege de complexe structuur van eiwitten en de verschillende ladingen die ze kunnen hebben, afhankelijk van de combinaties van de 20 aminozuren waaruit ze bestaan.

In dit proefschrift presenteert Kevin Huang een nieuwe manier om eiwitten met nanoporie te sequencen op een manier die vergelijkbaar is met traditionele massaspectrometrie-sequencing. Een eiwit kan worden omgezet in peptiden (kleine eiwitfragmenten) met enzymen. De peptidemassa is vervolgens te identificeren met nanoporiën in plaats van massaspectrometrie. Dit systeem kreeg de naam ‘nanoporie-peptidemassa-identificator’.

In vergelijking met de traditionele massaspectrometrische detectie is nanoporie-peptide-identificator een techniek die de detectiegevoeligheid zou kunnen verbeteren, waardoor het mogelijk zou zijn om eiwitten te detecteren die in ultra lage concentraties aanwezig zijn, en om veranderingen die na de productie van het eiwit zijn aangebracht in de cel (post-translatiemodificaties, PTM's) te identificeren.

Huang heeft eerst gewerkt aan de methode om alle peptiden met verschillende ladingscondities in de nanoporiën te vangen met behulp van Fragaceatoxin C (FraC) nanoporiën. Wild-type FraC-nanoporiën kunnen peptiden van minimaal 10 aminozuren lang detecteren, kortere peptiden gaan te snel door de porie om ze te kunnen meten. Daarom heeft hij zich gericht op de engineering van de grootte van FraC-nanoporiën, en zo kleine poriën gemaakt.

Nog belangrijker was om er voor te zorgen dat er een correlatie zou zijn tussen het signaal van de nanoporie en de peptidenmassa die zich erin bevindt. Alleen dan is een onbekend peptide te identificeren. Verder heeft Huang ook aanpassingen gemaakt om het mogelijk te maken grote gevouwen eiwitten te meten.

Het promotieonderzoek van Kevin Huang is verricht bij de afdeling Microbiële Fysiologie van het Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB) met financiering via de European Research Council (ERC). Huang werkt nu als onderzoeker aan de RUG.

Zie ook: Nieuwe methode meet individuele moleculen in bloed

en Doorbraak in detectie van eiwitten via nanoporie

Proefschrift: http://hdl.handle.net/11370/7d1e6385-b6fe-4ca7-a292-fd28396917cd