Antibody-free LC-MS/MS protein analysis of TRAIL
| Promotie: | Dhr. D. Wilffert |
| Wanneer: | 26 februari 2016 |
| Aanvang: | 14:30 |
| Promotors: | prof. dr. R.P.H. Bischoff, prof. dr. N.C. van de Merbel, prof. dr. W.J. (Wim) Quax |
| Waar: | Academiegebouw RUG |
| Faculteit: | Science and Engineering |
Kwantificatie eiwitten in biologische matrices zonder gebruik antilichamen
Het centrale thema van het proefschrift van Daniel Wilffert is de ontwikkeling van uiterst gevoelige vloeistof chromatografie – massa spectrometrie (LC-MS/MS) methodieken voor de kwantificatie van eiwitten in biologische matrices zonder het gebruik van antilichamen.
Een literatuurstudie in hoofdstuk 2 bespreekt het brede spectrum aan mogelijkheden van antilichaam-vrije methoden die toegepast kunnen worden bij eiwitkwantificatie met LC-MS/MS. In hoofdstuk 3 beschrijft Wilffert een antilichaam-vrije LC-MS/MS methode die een nauw gerelateerde DR4-specifieke variant rhTRAIL4C7 onderscheidt van het wild type rhTRAIL. Beide worden gemeten met een kwantificeringslimiet (LLOQ) van 20 ng/mL (350 pM) in humaan en muizenserum. De methode is volledig gevalideerd in overeenstemming met internationale richtlijnen en toegepast voor de bepaling van de farmacokinetische profielen van beide varianten, die tegelijkertijd zijn toegediend aan muizen.
In hoofdstuk 4 wordt een methode gepresenteerd waarin de monstervoorbewerking is uitgebreid met een initiële sterke kation-wisselings (SCX) SPE stap en waarin de LC scheiding is geminiaturiseerd door het gebruik van een LC-MS chip interface op microschaal. Dit levert een verbeterde opzuivering op en daardoor een toename in gevoeligheid in humaan serum tot 0.5 ng/mL (8.8 pM) rhTRAILWT, hetgeen dicht bij de LLOQ van 0.2 ng/mL (3.5 pM) ligt van een gevalideerde ELISA die al eerder werd toegepast in klinische fase 1 studies.
In hoofdstuk 5 wordt beschreven hoe de SCX verrijking op eiwitniveau wordt omgezet in een SCX verrijking op peptideniveau. Dit biedt voor het eerst de mogelijkheid tot het analyseren van endogene niveaus van sTRAIL met LC-MS/MS tot op een niveau van 3 pM in zowel sputum als speeksel.
Daniel Wilffert promoveert aan de RUG op onderzoek dat hij uitvoerde bij de vakgroep Analytical Biochemistry van het Groningen Research Institute of Pharmacy (GRIP) van de RUG. Het werd gefinancierd door NWO-STW (grant nr. 11056). Hij gaat verder als onderzoeker bij QPS (Groningen).