Single-molecule enzymology with a ClyA nanopore

Afzonderlijke enzymen bestudeerd in nanoporie

Het doel van het promotieonderzoek van Nicole Galenkamp was om via metingen in een nanoporie enzymen te bestuderen op enkel molecuul niveau. Zij is gestart met het ontwikkelen van een sensor op basis van een eiwit dat zich in de ClyA nanoporie bevindt, waarmee de concentratie glucose en asparagine gemeten kunnen worden. De concentraties van deze metabolieten in picoliters van onbehandeld bloed-, zweet- en urinemonsters konden binnen enkele seconden gelijktijdig en nauwkeurig worden bepaald.

Door mutaties aan te brengen in het glucose bindend eiwit, probeerde Galenkamp het mechanisme van binding van dit eiwit te begrijpen. Zij concludeert dat een netwerk waterstofbruggen van watermoleculen in het actief centrum waarschijnlijk een belangrijke en dominante rol speelt bij het bevorderen van de conformationele verandering die de sluiting van het eiwit rond glucose veroorzaakt.

Vervolgens bestudeerde Galenkamp de door liganden geïnduceerde conformationele veranderingen van het enzym dihydrofolate reductase (DHFR) met de ClyA nanoporie. De metingen onthulden verschillende DHFR blokkades, allemaal met onderscheidende affiniteiten voor zijn liganden. Dit toonde aan dat DHFR bestaat in ten minste vier afzonderlijke grondtoestand conformeren. Interconversies tussen de conformeren werden versneld tijdens de overgangstoestand conformatie van DHFR.

Bovendien kon Galenkamp de volledige reactiecyclus van DHFR volgen door de uitwisseling tussen vijf enigszins verschillende conformaties te bemonsteren. De enkele molecuul data onthulden de precieze hiërarchie van binding en de affiniteit van het enzym voor de verschillende reactie tussenproducten. Bemonstering van honderden opeenvolgende reacties van één enkel enzym onthulden zeldzame en tijdelijke tussenproducten langs de reactieroute evenals wanorde in het enzym.

Het promotieonderzoek van Nicole Galenkamp vond plaats bij de afdeling Microbiële Fysiologie van het Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute (GBB) met financiering van de European Research Council. Zij werkt nu als postdoc aan de RUG.

Zie ook Nieuwe methode meet individuele moleculen in bloed

en Enzym verandert van vorm tijdens katalytische reactie

Proefschrift: http://hdl.handle.net/11370/bb5669a5-2161-4eef-ad80-42479a37d138